Журнал «МЕДИЦИНА И КАЧЕСТВО ЖИЗНИ»
№ 4. 2012 г.
17
Количественная оценка паронтогенов
в норме и при пародонтите
Зорина О.А., Борискина О.А., Вали М.А., Ребриков Д.В.
ЦНИИС и ЧЛХ Минздравсоцразвития России
Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РА
Пародонтит это – заболевание бактериальной природы.
Его развитие провоцируют различные микроорганизмы,
среди которых значительная роль принадлежит
Porhpyromonas gingivalis, Treponema denticola, Tannerella
forsythensis (синонимы Bacteroides forsythus) и
Fusobacterium spp. Именно эти бактерии обнаруживают-
ся в пародонтальных карманах при микробиологичсе-
ком исследовании, и в настоящее время считается, что
совокупность этих микроорганизмов провоцирует раз-
витие воспалительных заболеваний пародонта. По дан-
ным различных исследований, ротовую полость челове-
ка населяют более 700 видов различных микроорганиз-
мов, однакоих идентификацияиколичественная оценка
до сих пор продолжается. В последнее время развитие
молекулярно-генетических методов исследования шаг-
нуло вперед, и большое распространение получил метод
ПЦР «в реальном времени» (из-за возможности коли-
чественного анализа бактериальных сообществ). При
исследовании содержимого пародонтального кармана
была показана взаимосвязь между относительным коли-
чеством T. forsythia и Fusobacterium spp. и глубиной кар-
мана, из которого был взят образец (r=0,48 для T.
forsythia, и r=0,50 для Fusobacterium spp., p<0,001). Также
было обнаружено достоверное постоянное соотношение
между этими бактериями в пародонтальном кармане
(r=0,75, p<0,001). Полученные данные позволяют гово-
рить о возможности применения количественной ПЦР
«в реальном времени» для более точного определения
взаимодействия между отдельными представителями
пародонтопатогенной микрофлоры.
Целью данного исследования являлась количест-
венная оценка соотношения наиболее важных пред-
ставителей патогенной микрофлоры пародонтальных
карманов: Aggregatibacter actinomycetemcomitans,
Porhpyromonas gingivalis, Prevotella intermedia,
Tannerella forsythensis (Bacteroides forsythus),
Treponema denticola в группе здоровых индивидов и у
пациентов с диагнозом хронический генерализован-
ный пародонтит средней степени тяжести.
Материалы и методы.
Был обследован 31 пациент
(13 мужчин и 18 женщин) в возрасте от 30 до 60 лет
без системных заболеваний с диагнозом хронический
генерализованный пародонтит (ХГП) средней степе-
ни тяжести. Критериями ХГП средней степени слу-
жило нарушение целостности зубодесневого соеди-
нения, глубина пародонтальных карманов (ПК) от 3
до 5 мм, деструкция кортикальной пластинки и кост-
ной ткани межзубных перегородок на 1/2-1/3 длины
корня, патологическая подвижность зубов 1-2 степе-
ни. Контрольную группу составили 29 человек (11
мужчин и 18 женщин) в возрасте от 30 до 55 лет.
Для исследования микрофлоры интактного паро-
донта и пародонтальных карманов использовали сте-
рильные бумажные эндодонтические штифты (размер
№25), которые погружали в десневую бороздку или в
патологический карман до его дна и оставляли на 10
секунд. Затем помещали в пробирку с физиологичес-
ким раствором и транспортировали в лабораторию в
охлажденном состоянии. У каждого пациента забор
материала дублировался. Для выявления инфекцион-
ных агентов и определения геномной ДНК пациента
(как нормировочного показателя) экстракцию ДНК
из биологического материала проводили с помощью
комплектов для экстракции ДНК «Проба-ГС» (ООО
«НПО ДНК-Технология», Россия) согласно прилагае-
мой инструкции. Метод основан на сорбции ДНК на
носителе, отмывке примесей и последующей элюции
нуклеиновых кислот с сорбента. За счет лизиса клеток
сильными хаотропными агентами «Проба-ГС» при-
мерно с равной эффективноситю разрушает клетки с
различным типом клеточной стенки (грамположи-
тельных, грамотрицательных бактерий, грибов). Также
«Проба-ГС» подходит и для экстракции геномной
ДНК эукариот (которая была использована в исследо-
вании в качестве нормировочного показателя).
В работе были использованы ранее разработанные
наборы реагентов, состоящие из специфичных прайме-
ров и специфичной флуоресцентно меченой разрушае-
мой пробы (типа TaqMan), к шести пародонтопатоген-
ным агентам (Aggregatibacter actinomycetemcomitans,
Porhpyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Tannerella
forsythensis (Bacteroides forsythus), Treponema denticola,
Candida albicans). С целью оценки общей бактериаль-
ной массы, представленной в образце, параллельно с
исследованием патогенных микроорганизмов, прово-
дили ПЦР с детекцией консервативного участка гена
16S рРНК. Для возможности сравнения представлен-
ности патогенов в различных образцах количество
копий геном-эквивалентов бактерий каждого вида (а
также общая бакмасса) нормировались относительно
количества геномной ДНК человека (определенной по
количеству фрагмента гена рецептора гормона роста).
ПЦР проводили с помощью детектирующего амп-
лификатора «ДТпрайм» (ООО «НПО ДНК-
Технология», Россия). Учет результатов реакции
проводили с помощью программного обеспечения
детектирующего
амплификатора
«ДТпрайм».
Нормированные значения, соответствующие уровню
представленности каждого микроорганизма, рассчи-
тывали с помощью метода ??Ct [12].
Результаты и обсуждение.
Для приведения коли-
чества взятого в исследование биоматериала к едино-
му знаменателю данные были нормированы по содер-
жанию уникального фрагмента геномной ДНК чело-
века (фрагмент гена рецептора гормона роста).
В группе пациентов с ХГП средней степени тяжести
количество всех исследованных микроорганизмов
(включая и общую бактериальную массу) значитель-
